諾博萊德 無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒  核酸提取

EndoFree Plasmid Mini Kit無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量快速提試劑盒

目錄號(hào)：31014

產(chǎn)品內(nèi)容:

保存條件:

在室溫(15 ~ 25℃)干燥條件下，可保存 12 個(gè)月。

RNase  A、內(nèi)毒素清除劑，可常溫運(yùn)輸，-20℃保存。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介:

無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒采用改進(jìn)的SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞，通過獨(dú)te的內(nèi)毒素清除劑選擇性結(jié)合離心除去內(nèi)毒素，然后離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除，最后低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。所得質(zhì)粒可直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、RT-qPCR、測(cè)序及轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

產(chǎn)品特點(diǎn):

1.         獨(dú)te工藝配方清除內(nèi)毒素，內(nèi)毒素含量極低（< 0.1 EU/ug DNA），細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果極jia。

2.         得率高：1.5 - 4.5ml 菌液可提出多達(dá) 20 - 50 ug 的純凈質(zhì)粒；

重要提示：

一、使用前請(qǐng)先檢查平衡液、溶液 P2 和溶液 N3 是否出現(xiàn)渾濁，如有混濁現(xiàn)象，可在 37℃

水浴中加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。

二、第一次使用前，請(qǐng)先在去蛋白液 PE、漂洗液 WB 中加入無水乙醇，請(qǐng)參照瓶上的標(biāo)簽。三、首ci使用時(shí)請(qǐng)先將 RNase A 全部加到溶液 P1 中，混勻，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存。

操作步驟：

1.  柱平衡：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入 100 ul 的平衡液，12,000 rpm 離心 1 min，棄收集管中濾液，將吸附柱重新放回收集管中。

2.   取 1 ~ 5 ml 過夜培養(yǎng)的菌液，室溫 12,000 rpm 離心 30 sec，盡量倒干上清，收集菌體。

（注意：根據(jù)菌液的濃度決定取液量，濃度高時(shí)取 1.5 ml 菌液離心即可，濃度低時(shí)可多收集一次）

3.  加入 250 ul 溶液P1，重懸菌體沉淀，渦旋震蕩至徹di懸浮。

（注意：如有未徹di懸浮的菌塊會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取的質(zhì)粒濃度及純度降低）

4.  加入 250 ul 溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次，使菌體充分裂解，室溫放置 4 min。

（注意：不可劇烈震蕩，以免造成基因組 DNA 片段的污染，所用時(shí)間不要超過 5 min，以免質(zhì)粒受到破壞，如未完quan變得清亮，可能是菌體太多，可增加溶液 P2 的用量，在后續(xù)的操作中溶液 P3 的用量也要相應(yīng)增加）

5. 加入 250 ul 溶液 N3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次，充分混勻時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，然后室溫 13,000 rpm 離心 10 min，小心取上清至新管，避免吸到白色漂浮物。

（注意：加入溶液 P3 后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生 SDS 的局部沉淀）

6.  加入 0.1 體積 (上清的體積的 10%，約 80 ul) 的內(nèi)毒素清除劑到上一步所得上清，顛倒旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴或者插入碎冰中(或冰箱冷凍室)放置 5 分鐘，直到渾濁變清亮透明（或仍舊稍有渾濁），中間偶爾混勻幾次。

（注意：內(nèi)毒素清除劑加入上清后，上清會(huì)變得渾濁，但是冰浴后應(yīng)恢復(fù)清亮,或稍渾濁。）

7. 常溫放置 3 ~ 5 分鐘，溫度恢復(fù)室溫溶液很快變?yōu)闇啙?，顛倒混?/span>。（37℃可加速渾濁）

8. 室溫 15,000 rpm 離心 10 分鐘分相 。上層水相含 DNA，下層藍(lán)色油狀相含內(nèi)毒素和其它雜質(zhì)。將含 DNA 的上層水相轉(zhuǎn)移到新管（注意不要吸到藍(lán)色油狀層，里面含內(nèi)毒素等雜質(zhì)），棄油狀層。

9.向上層水相中加入 0.5 體積異丙醇（約 370 ul），充分顛倒混勻，分兩次（每次不超過700 ul）轉(zhuǎn)入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm 離心 1min，質(zhì)粒被吸附在膜上，倒掉收集管中的濾液，直到所有混合溶液通過此吸附柱。

10.      可選步驟：向吸附柱中加入 500 ul 去蛋白液 PE，室溫 12,000 rpm 離心 30 sec，棄濾液。

（注意：去蛋白液 PE 為濃縮液，按要求加入無水乙醇，用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋，以防酒精揮發(fā)）

（注意：如果宿主菌是 endA-，如 DH5α ，此步驟可省略。如果宿主菌是 endA+，如 TG1、BL21、 HB101、JM101 等，此步驟不可省略，因這些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解質(zhì)粒。如果提取低拷貝質(zhì)粒也推薦采用此步驟）

11.        加入 600 ul 漂洗液 WB，室溫 12,000 rpm 離心 30 sec，棄濾液。

（注意：漂洗液 WB 為濃縮液，按要求加入無水乙醇，用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋，以防酒精揮發(fā)）

12.       重復(fù)步驟 11 一次。

13.        室溫 12,000 rpm 離心 2 min，甩干殘留液體，以免殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

14.      將吸附柱置于一個(gè)新的 1.5 ml 離心管（自備）中，加入 50 ~ 100 ul 的洗脫緩沖液 EB，室溫放置 2 min，12,000 rpm 離心 1 min，離心管底溶液即質(zhì)粒 DNA。

（注意：事先在 65~70℃水浴中預(yù)熱洗脫緩沖液 EB，可增加洗脫效率；

如果需要較多量質(zhì)粒，可將得到的溶液重新加入吸附柱中，再次離心 1 min 收集；如需使用去離子水洗脫，可用 NaOH 調(diào)整其 pH 值在 7.0 - 8.5 之間。）

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