諾博萊德 固定包埋組織DNA快速提取試劑盒

固定包埋組織DNA快速提取試劑盒（離心柱型）

目錄號(hào)：40312

v  適用范圍：

適用于快速提取各種福爾馬林固定和石蠟包埋組織DNA

v試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性：

本試劑盒在室溫儲(chǔ)存12個(gè)月不影響使用效果

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

儲(chǔ)存事項(xiàng):

1.結(jié)合液CB或者抑制物去除液IR低溫時(shí)可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。

2.為避免降低活性、方便運(yùn)輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后，10mg/20mg加入0.5ml/1ml滅菌水溶解，因?yàn)榉磸?fù)凍融可能會(huì)降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分裝凍存，－20℃保存。

3.避免試劑長時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。

v 產(chǎn)品介紹：

福爾馬林固定或者石蠟包埋組織通過獨(dú)te裂解液熱處理和蛋白酶K共同作用迅速裂解細(xì)胞釋放出基因組DNA，然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

v 產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.  離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好?？朔藝a(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。

2. 不需要使用有毒的ben酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。

3. 快速，簡捷，單個(gè)樣品操作一般可在30分鐘內(nèi)完成。

多次柱漂洗確保高純度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值達(dá)1.7～1.9，長度可達(dá)30kb -50kb，可直接用于PCR，Southern-blot和各種酶切反應(yīng)。

v 注意事項(xiàng)：

1. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。

2. 需要自備乙醇（需要準(zhǔn)備100%/80%/60%/40%不同濃度）或者二甲苯。

3. 實(shí)驗(yàn)前將需要的水浴先預(yù)熱到37℃?zhèn)溆谩?/span>

4. 結(jié)合液CB 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

5. 洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫，但應(yīng)該確保批pH大于7.5，pH過低影響洗脫效率。用水洗脫DNA應(yīng)該保存在－20℃。DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。

v  操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）

提示：第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB中加入指ding量無水乙醇，充分混勻，加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!

1. 將組織切片放入離心管子，浸泡在二甲苯中脫蠟約30分鐘（具體時(shí)間根據(jù)切片厚度調(diào)整）。

2. 將切片依次放入100%乙醇/80%乙醇/60%乙醇/40%乙醇/去離子水，每個(gè)液體中浸泡10秒鐘重新水化切片。

剛放入100%乙醇時(shí)，應(yīng)該見到切片變白。

3. 顯微鏡觀察下，用刀片切下擬提取DNA的目標(biāo)組織，放入預(yù)先稱重的1.5ml離心管。再次稱重，計(jì)算出切片組織重量。

4. 在25-50mg組織中加入200μl裂解液FTL,再加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立即混勻混勻后置37℃水浴過夜。

5. 再加入10μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，混勻后55℃水浴1-2小時(shí)。

此步驟后，不應(yīng)該見到粗大的組織顆粒了。

6. 加入200μl 結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩20秒充分混勻后置70℃水浴10分鐘。

7. 冷卻后加入100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩30秒充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。

8. 用1毫升的槍頭吸取混合物，將混合物加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液。

如果有不溶組織物可能堵住槍頭，可將槍頭在吸水紙上輕蹭去除不溶物；如果吸上來的混合物少則可以將槍頭和不溶物一起棄去，該做法是為了去除不溶物，以免堵塞離心柱。。

9. 加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 離心30秒，棄廢液。

10. 加入700μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

11. 加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

12. 將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

13.  取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65-70℃水浴中預(yù)熱效果更好）， 室溫放置3-5分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積，但是最小體積不應(yīng)少于50μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。

14. DNA可以存放在2-8℃，如果要長時(shí)間存放，可以放置在－20℃。

v 附錄：另外一種脫蠟方式

1.將目標(biāo)組織切片放入離心管，加入1ml 100%二甲苯，渦旋振蕩10秒。瞬間離心把組織全部浸入到二甲苯。

2. 50℃水浴3分鐘熔解石蠟，20-25℃最高速離心2分鐘，收集組織到管底。

3. 小心用移液器吸棄上清二甲苯，注意不要吸到沉淀。

4. 加入1ml無水乙醇，渦旋振蕩，最高速離心2分鐘，小心吸棄上清乙醇。

5. 加入1ml無水乙醇，重復(fù)步驟6一遍，盡可能吸棄所有乙醇。

6. 室溫或者37℃ 晾干乙醇10分鐘或直到所有乙醇揮發(fā)干。

v  問題與解決方法：